Е.И.Рогаев, И.В. Овчинников, П.Джорж-Хислоп (Канада), Е.А.Рогаева СРАВНЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК Т.Н.КУЛИКОВСКОГО-РОМАНОВА, ПЛЕМЯННИКА ЦАРЯ НИКОЛАЯ II РОМАНОВА, И ДНК ПРЕДПОЛАГАЕМЫХ ОСТАНКОВ ЦАРЯ

Проведен анализ двух полиморфных участков митохондриальной ДНК Т.Н.Куликовского-Романова, племян ника последнего царя Российской Империи Николая 11 Романова. Последовательности митохондриальной ДНК Т.Н.Куликовского-Романова и опубликованные ранее по следовательности для предполагаемых останков Николая II показали практически полное совпадение. Обнаружено не совпадение только одного нуклеотида в позиции 16169: С - Т.Н.Куликовского-Романова, С/Т - в предпола- гаемых останках Николая 11 Романова, Т - у праправнука и прапраправнучки Луизы Гессе-Кассел.

Эти данные свидетельствуют о независимых мутациях в материнских линиях потомков Луизы Гессе-Кассел и/или мутации, ведущей к гетероплазмии в линии Луизы Гессе-Кассел. ДНК-генотипоскопия ("геномная дактилоскопия", "ДНК-отпечатки пальцев") признана наиболее информативным методом для идентификации личности по биологическим образцам и установления или исключения близкого род ства (отцовства или материнства).

Для этих целей используются различные технологии анализа ДНК и разнообразные полиморфные участки (маркеры) ядерной и митохондриаль ной ДНК. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет получать информативные профили ДНК даже на частично деградированном генетическом материале из старых и древних биологических образцов.

Эти методы, однако, требуют принятия строгих критериев достоверности результатов. К основным проблемам, которые могут приводить к ложным идентификациям, можно отнести:

1) недостаточное знание частот полиморфных маркеров в различных этнических популяциях;

2) отсутствие единых статистических стан- дартов для позитивных идентификаций (особенно в случаях установления родства);

3) загрязнение анализируемых биоло- гических образцов;

4) неизвестный уровень спонтанных мутаций, приводящий к противоречивым результатам. До недавнего времени считалось, что последний царь Российской Империи Николай II Романов, его семья и обслуживающий персонал были казнены большевиками в ночь с 16 на 17 июля 1918 г., а их тела полностью уничтожены кис- лотой и огнем. Однако не так давно могила, содержащая несколько человеческих скелетов, была обнаружена недалеко от г. Екатеринбурга.

На основе ряда архивных данных и патологоморфологических исследований судебных экспертов было выдвинуто предположение, что могила содержит остан- ки семьи Романовых. Метод анализа ДНК был применен для доказательства подлинности найденных останков.

Первые ДНК-тесты, проведенные Британской Службой судебных наук, в значительной степени подтвержали, но не доказали это предположение [1]. Наиболее спорные результаты были получены при анализе предполагаемых костных останков Николая II и его ныне живущих родственников. При анализе предполагаемых останков Николая II и его дальних родственников по материнской линии было возможно только сравнение митохондриальной ДНК.

Хотя было обнаружено значительное совпадение (кроме одного нуклеотида) в митохондриальной ДНК, но вероятность такого сов- падения не достаточно высока, и вопрос о позитивной иден- тификации остается открытым. Более того, была обнаружена гетерогенность в позиции 16169 митохондриальной ДНК, выделенной из предполагаемых останков Николая II (С- или Т-нуклеотид).

Такая гетерогенность была интерпретирована как доказательство гетероплазмии в костях. В то же время гомоплазмия в этом участке ДНК является общим правилом для митохондриальной ДНК человека. Чтобы прояснить эти вопросы, мы предприняли анализ ДНК более близких родственников царя Николая II Романо- ва. Ближайшим родственником Николая II, жившим до недавнего времени в Торонто (Канада), был его племянник Тихон Николаевич Куликовский-Романов. Тихон Николаевич Куликовский-Романов является сыном Великой княгини Оль- ги (родной сестры Николая II) и праправнуком Датского короля Кристиана IХ. Таким образом, по материнской линии Николай II и Т.Н.Куликовский-Романов должны наследовать одну и ту же линию митохондриальной ДНК от императрицы Марии Федоровны (до крещения Датской принцессы Дагмары), жены императора Александра III.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

60 С - 30 с, 72 С - 30 с. Для ПЦР участка HVR1 митохондриальной ДНК использовали следующие олигонуклео- тидные праймеры: Н16401 - ТGАТТТCАCGGАGGАТGGТG и L15997 - САССАТТАGСАСССАААGСТ, а для ПЦР участка HVR2 - праймеры Н00376 - ТGАААТСТGGТТАGGСТGGТ и L00029 - GGТСТАТСАСССТАТТААССАС [3]. Три технических подхода было использовано для секвенирования митохондриальной ДНК:

1) амплификация участков HVR1 и HVR2 митохондри- альной ДНК с помощью АmpliТаq-полимеразы с последую- щим прямым секвенированием продукта ПЦР;

2) амплификация участков НVRК1 и HVR2 митохондриальной ДНК с помощью PfUI-полимеразы, на порядок сни- жающей вероятность ошибки во время реакции по сравнению с АmpliTаq-полимеразой. Затем элюция из агарозного геля продукта ПЦР и его секвенирования;

3) клонирование РfUI-ПЦР-фрагментов митохондриальной ДНК в вектор рВSК и секвенирование отдельных клонов, содержащих фрагменты митохондриальной ДНК. Получение идентичных результатов всеми тремя методами гарантировало надежность результата. Во всех случаях секвенирование осуществлялось с помощью секвенатора фирмы "Аррlied Вiosystems" (США) с ютоматической записью нуклеотидной последовательности в компьютерные данные, что исключало возможность субъективной интерпретации результатов. Секвенирование РfUI-ПЦР продукта (НVR1 область) с по- мощью праймера L 15997, Сигналы полной нуклеотидной последовательности фрагмента НVR1 митохондриальной ДНК Т.Н.Куликовского-Романова.

Стрелкой отмечена пози- ция 16169-С ("гетероплазмический" вариант С/Т в предпола- гаемых останках Николая 11). Показано отсутствие гетеро- плазмии в позиции 16169-С. Сравнение последовательностей митохондриальной ДНК Т.Н.Куликовского-Романова и его предполагаемых род- ственников. Приведены только полиморфные позиции нуклеотидов, отличающиеся от "контрольной" митохондри- альной ДНК, опубликованной ранее [4]. РЕЗУЛЬТАТЫ И

ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение последовательностей митохондриальной ДНК Т.Н.Куликовского-Романова и опубликованных ранее для образца скелета Мо 4 (предполагаемые останки царя Николая 11), а также дальних родственников показало значительное совпадение в последовательностях митохондриальной ДНК (рис. 1). Однако цитозин (С) в положении нуклеотида 16169 митохондриальной ДНК Т.Н.Куликовского-Романова отли- чается от митохондриальной ДНК дальних родственников царя (16169-Т), но совпадает с одним из вариантов "гетероплазмии" скелета Мо 4 (16169-С/Т) (рис. 2).

Эти данные можно интерпретировать следующим образом:

1) независимые мутационные события, отражающие вы- сокий мутационный уровень, могут существовать в материн- ской линии потомков Луизы Гессе-Кассел;

2) редкое явление "гетероплазмии" может существовать в митохондриальной ДНК Луизы Гессе-Кассел, сохраняясь как "гетероплазмия" (С/Т) в останках Николая II или превращаясь в "гомоплазмию" (С или Т) в ДНК более далеких потомков. В то же время нельзя исключить того, что опубликованная ге- терогенность С/Т в позиции 16169 митохондриальной ДНК скелета # 4 [1] также могла быть объяснена загрязнением действительных образцов Николая 11 (или другого индивида с цитозином в позиции 16169) образцами сравниваемых родственников.

Эти данные, разумеется, не опровергают подлинность останков царя Николая 11 Романова, а лишь с очевидностью демонстрируют необходимость в дополнительном лабора- торном анализе ДНК. До сих пор нет полных данных о час- тоте полиморфных вариантов и спонтанных мутаций в об- ластях НVR1 и HVR2 митохондриальной ДНК для различ- ных этнических популяций (например, датских, немецких или русских).

Таким образом, необходимы сравнительный анализ ДНК с использованием популяционных данных для митохондриальной ДНК и применение более информативных маркеров. Для проверки гипотезы тесного родства может быть дополнительно использован анализ с помощью микросателлитов или простых тандемных повторов (STR) ДНК.

Таким образом, полученные в данной работе результаты позволяют сделать следующие выводы:

1) анализ полиморфных последовательностей мито хондриальной ДНК Т.Н.Куликовского-Романова и опубликованных ранее последовательностей митохондриальной ДНК предполагаемых останков Николая II Романова (скелет № 4) показал по существу полное совпадение.Эти данные подтверждают гипотезу подлинности останков Николая II Романова (в том случае, если имеются безспорные доказательства, что опубликованная последовательность ДНК скелета № 4 не может являться результатом загрязнения митохондриальной ДНК сравниваемых родственников-потомков Луизы Гессе-Кассел, анализируемой в одной и той же лаборатории) [1];

2) обнаружено несовпадение одного нуклеотида: Т.Н.Куликовский-Романов (16169-С), праправнук Луизы Гесен-Кассел (16169-Т), прапраправнучка Луизы Гессе-Кассел (16169-Т), предполыаемые останки Николая 11 (16169-С/Т).

Эти данные свидетельствуют о независимых мутациях в материнских линиях потомков Луизы Гессе-Кассел и/или мутации, ведущей к гетероплазмии в линии Луизы Гессе-Кассел;

3) обнаружение явления мугации/гетероплазмии, не опи- санной ранее в генетических исследованиях, с точки зрения формальной генетики затрудняет использование самой мута- ции для расчета вероятности случайного совпадения в двух сравниваемых последовательностях ДНК. Только научное явление, описанное и устоявшееся, обычно используется в экспертизах как доказательство;

4) для достижения высокой вероятности позитивной идентификации сравниваемых образцов (р < 10 в минус 8-ой - 10-ой степени) необходим дополнительный анализ высокоинформативных участков ДНК. Торонто - Москва, 1996 г.

ЛИТЕРАТУРА 1. Gill P., Ivanov P.L., Kimpton C et al. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analisis // Nature Genetics. 1994. V. 6. P. 130-135. 2. Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material // Bio Techniques. 199 1. V. IO. P. 506-513. 3. Sullivan KM., Hopgood R., Lang B., Gill P. Automated amplification and sequencing of human mito4ondrial DNA // Electrophoresis. 1991. V. 12. P. 17-21. 4. Anderson S., Bankier A.T, Barrell B.G. et aL Sequence and organization of the human mitohondrial genome // Nature. 198 1. V. 290. P. 457-465.