ВЗГЛЯД НА ИСТОРИЮ ЧЕРЕЗ ПРИЗМУ

ГЕНЕТИЧЕСКИX ИCCЛЕДОВАНИЙ

Макеев С.Г., Измаилов И.Х., Тарасевич Л.Л.. Костюкова С.В., Зубанов П.С.. Улыбин Л.И.

Уральская государственная медицинская академия, Лаборатория молекулярных медицинских технологий СрУрНЦ Российской академии медицинских науки Правительства Свердловской области

Исполнилось 12 лет с тех пор, как было официально вскрыто групповое захоронение на Старой Коптяковской дороге под Екатеринбургом, ранее обнаруженное группой A.Н. Авдонина. Изначально происхождение захоронения связывалось с семьей последнего русскою Императора, расстрелянной в ночь с 16 на 17 июля 1918 года, а все последующие усилия были направлены на поиск соответствующих доказательств.

Первый этап исследований включал краниофациальную идентификацию, медико-антропологическую, судебно-стоматологическую экспертизы и судебно-медицинскую оценку повреждении костей. Кроме этого этап включал генетическую экспертизу в Алдермастонском Криминалистическом центре МВД Великобритании, завершенную в 1993 году. Генетическое исследование основывалось на анализе последовательности D-петли митохондриальной ДНК (мтДНК), экстрагированной из костных останков. Одновременно была предпринята попытка воссоздания Гессенской родословной линии, к которой относится Николай Романов (Рис. 1)

Для этого была изучена последовательность фрагментов мтДНК образцов крови прямых потомком ветви - принца-консорта Филиппа, герцога Эдинбургского, мужа королевы Великобритании (пра-правнук Луизы Гессен-Кассель. дистанция 4 поколения) и графини Ксении Шереметевой Сфири (пра-пра-правнучка Луизы Гессен-Кассель, дистанция 5 поколений) в сравнении с последовательностью мтДНК фрагментов скелета №4, предположительно Николая Романова (внук Луизы Гессен-Кассельд, дистанция 2 поколения).

Итогом исследования, имеющим важнейшее значение для дальнейшей идентификации останков, было выявление несовпадения последовательности нуклеотидов цепи мтДНК в положении 16.169 между ныне живущими потомками и фрагментом скелета №4. Одновременно в мтДНК скелета №4 была выявлена, как тогда считали, редчайшая «гетероплазмия» -присутствие у одного объекта как мутантного генома (мутантный нуклеотид тимин - Т в положении 16.169,. так и генома «дикого» или естественного тина, присущего остальному населению (цитозин - С). Заключение об уникальности гетероплазмии было сделано на основании сравнения с данными о 4.950 разновидностях участка D-петли мтДНК, имевшихся на тот период в базе данных центра.

Вместе с тем, факт мутационного изменения мтДНК в Гессенской родословной линии к концу I этапа экспертизы окончательно не был установлен, а вероятность принадлежности костного образца скелета №4 Николаю Романову, по мнению экспертов, составила 70:1 (неопределенная модель). Поэтому, с точки зрения современной криминалистики «...результат нельзя было считать достаточно доказательным для такого экстраординарного случая» [1].

Следует отметить, что неопределенность идентификации явилась следствием впервые зарегистрированного феномена гетероплазмии и невозможностью апеллировать к другим базам данных, содержащих сведения о распространенности выявленной мутации.

Для подтверждения мутационной природы гетероплазмии, в 1995 г. исследования были продолжены в Военно-медицинском институте Министерства обороны США. Проводился сравнительный анализ образцов мтДНК из фрагментов скелета №4 и мтДНК из костной ткани младшего брата Николая Романова Георгия, умершего в 1898 году и похороненного в Санкт-Петербурге (Рис. 1). К сожалению, в США не исследовались остальные объекты, ранее изучавшиеся в Великобритании.

В процессе анализа мтДНК Георгия Романова присутствие гетероплазмии в положении 16.169 было подтверждено с несколько иным соотношением, чем у фрагмента скелета №4 (у Георгия отношение цитозин/тимин (С/Т) - 40/60: у скелета №4 С/Т - 70/30).

На основании 2 этапа исследований был сделан вывод о том, что в Гессенской ветви Романовых произошла мутация мтДНК, проявившаяся у обследованных объектов в виде гетероплазмии. Последняя явилась результатом дифференциальной сегрегации общего пула материнской мтДНК. который, предположительно, также был гетероплазмичным. В свете этих данных гомоплазмичное состояние мутации у обследованных представителей потомков Луизы Гессен-Кассель четвертого и пятого поколении, по мнению исследователей, должно свидетельствовать о фиксации мутации, указывающей на мутационную природу выявленных различий. Полученные результаты позволили перейти к определенно-мутационной модели с вероятностью позитивности идентификации скелета №4 как принадлежащего Николаю Романову 1:84.800.

На сделанное заключение никак не повлиял ряд несоответствий, в частности крайне высокие темпы (в 2 раза за три года) сегрегации мутантной мтДНК у матери Николая ( 1968 г. рождения, доля мутантного тимина 30% ) и Георгия ( 1871 г. рождения, доля мутантного тимина 60%), а так же результаты тестирования образца крови родного племянника Николая II - Т.Н. Куликовского-Романова. выполненные в 1997 году Татсуо Нагаи в Университете Китасато (Япония) и не совпавшие с выявленными особенностями мтДНК скелета №4.

Определяющим звеном всей идентификации могло стать изучение мтДНК матери Николая и Георгия Романовых - Императрицы Марии Федоровны (дочь Луизы Гесссен-Кассель, дистанция 1 поколение), останки которой находятся в королевской усыпальнице в Дании и ее родной сестры - Елизаветы Федоровны.

Историческое значение мог иметь и сравнительный анализ мтДНК останков Е.С. Боткина и его отца - знаменитого русскою терапевта С.П. Боткина. Однако результаты исследований были признаны достаточными, а их продолжение нецелесообразным, тем более, что приближались «круглые» даты - связываемый с именем Б.Н. Ельцина снос дома Ипатьева (1978 г.) и, наконец, июль 1998 года. Поэтому дополнительные исследования, а значит сомнения в уже сделанных выводах, могли помешать процедуре публичною покаяния.

Между тем сомнения остались, чему способствуют воспоминания участников тех событии, в частности Анатолия Ивановича Парамонова, демонстрировавшего захоронение гостям, в том числе В.В. Маяковскому (в 1928 г.). Член городского совета, а затем его председатель в личной беседе с автором рассказывал, что в одно время с царской семьей была расстреляна еще одна - местного купца, обвиненного в противодействии властям, но о ней вспомнили только после первичного захоронения останков царской семьи в шахте. Заметив свидетеля этою события, исполнители решили перезахоронить в шахте останки купеческой семьи, а царской - сжечь.

Однако ввиду высокой влажности дрова не горели, а керосина хватило для уничтожения только двоих (Алексея и его сестры). Поэтому часть трупов из одной семьи была перезахоронена с другими с целью помешать поискам, тем более, что передовые отряды Колчака были уже на подступах к городу. В связи с этим из могилы на Коптяковскои дороге не делали секрета - потому, что... «Ннколашки там и не бывало».

Второе захоронение(ия), скорее всего, было произведено поблизости, но был ли там труп Николая Романова - неизвестно. Отсюда, по-видимому, уверенность к том, что «мир об этом никогда не узнает». (II.JI. Войков).

Принимая во внимание возможное присутствие в захоронении местных геномов, важным фактором, способным внести дополнительную неопределенность, является генетический полиморфизм генофонда жителей Уральского региона.

В последние годы получены данные исследования мтДНК жителей соседних peгионов, которые подтверждают, что к западу и востоку от Урала обитают разные расы - европеоиды и монголоиды, а генофонд местного населения вобрал в себя все разнообразие известных в мире геномов.

Формирование уникального генофонда с исторической точки зрения происходило в три этана:

1. Первичная миграция людей 60-70 тыс. лет назад - перенос через Урал монголондных и европеоидных геномов.

2. Великое переселение кочевых народов из Сибирских «ядер» расообразования менее 10000 лет назад --- обратный перенос геномов, сформировавших современное население Европы. Войны, уничтожившие целые народы, и связанные с изменчивым плодородием южноуральских степей большие и малые миграции, оставили на Урале свои след. Спасительная миграция кочевых племен была направлена не только на запад, но и на север, где в суровых климатических условиях до сих нор сохранился уникальный генофонд.

3. Современные миграции и переселения, связанные с открытием и освоением новых земель – последние 500 лет.

Вероятно поэтому у 17% этнических русских — коренных уральцев встречаются уникальные ДНК-мутации, имеющиеся в мире только у бурят, татар, мордвы, якутов (до 80%) и более чем у 20% современных финнов (замена 'I' на С и сходные микросателлитные наборы в У-хромосомс). В свою очередь, у уральских монголоидов присутствуют маркеры, характерные для типичных современных европеоидов (например, в положении 10.394. но не 10.397 мтДМК).

В связис возможным присутствием в костных останках следов уральских геномов и сомнениями и результатах генетических тестов, высказанных и личной беседе с Александром Николаевичем Авдониным, был предпринят анализ основных доказательных элементов:

- исследование возможности присутствия мутации в положении 16.169 мтДИК в геномах лиц, не имеющих очевидных родственных связен с потомками Луизы Гессен-Кассель;

- с позиции современных данных оценить частоту встречаемости гетероплазмии среди известных мутаций мтДНК.

Признание мутантного происхождения мутации мтДНК. в положении 16169 обусловил поиск подобной мутации у контингента жителей территории Восточно-Уральского радиационного следа Свердловской области, первое поколение которых проживало в зоне максимального загрязнения. Именно у этой группы зафиксированы наибольшие темны накопления мутации в митохондриальном геноме |2|.

В лаборатории молекулярных медицинских технологии УI'MА в течение ряда лет проводится отбор и исследование ДНК жителей Уральскою региона, часть которой пополняет внутрилабораторный банк ДНК. Исследовалась нуклеотидная последовательность фрагмента D-петли мтДНК 120 человек - современных жителей Каменского района Свердловской области. Выполнение задачи было значительно облегчено целевым поиском мутации в положении 16.169 из более чем тысячи нуклеотидных пар D-петли мтДНК.

Для решения задачи применяли секвенирование с использованием меченых дидезокси-нуклеозидтрифосфатов (Amersham) по методу Ф. Сенгера [ 1б|, блокирующих 3'-конец - ди-дезоксиаденозина (для выявления комплементарного тимина) н дидезоксигуанозина (для выявления цитозина) в избранном коротком участке D-петли мтДНК, располагающегося рядом с участком связывания праймера.

Оказалось, что у одной жительницы Каменского района, чьи родители были отселены после аварии 1957 года на ПО «Маяк» вследствие высокого радиационного загрязнения в положении 16.169 выявлена трансцизия нуклеотида, качественно совпадающая с классической Гессенской мутацией. Интересно, что аналогичная мутация определена и у ее сына. Этo подтверждает «неслучайность» данного отклонения, переданного ребенку от матери.

Последовательности участков D-петли мтДНК из фрагментов костей скелетов № 4 и Георгия Романова, крови Ксении Шереметевой-Сфири [1] и последовательности D-петли матери и сына Н.. представлены на рисунке 3 (стрелкой отмечено положение 16.169).

К сожалению, использованная методика не позволила дифференцировать данную му-тацию по признаку плазмии. Так же не дифференцировалась возможная принадлежность семьи Н. к Гессенской ветви, хотя уже само предположение о проживании потомков той ветви по материнской линии в одной из деревень Свердловской области вряд ли заслуживает серьезною обсуждения.

По-видимому, появление подобной мутации могло быть обусловлено либо краевым характером данной мутации (распространенностью в местной популяции), либо высоким мутагенным фоном территории (не только техногенного, но и природного происхождения).

В том случае, если допустить возможность присутствия в захоронении местных геномов, а так же если дальнейшие исследования подтвердят распространенность данной мутации в генофонде уральских жителей, тогда вероятность позитивности идентификации скелета №4 как останков Николая Романова резко снизится.

Ключевым положением экспертизы скелета №4. позволившим сменить неопределенную модель на определенную, стала впервые выявленная гетероплазмия.

Следует отметить, что 11 лет, прошедших с первого выявления гетсроплазмии характеризовались накоплением сведений о вариантах, качественных и количественных параметрах мутаций мтДНK. В настоящее время многие данные свидетельствуют о чрезвычайно высокой распространенности этого явления [3, 4. 5. 6. 7. S, 9. 10, 11. 12. 13, 14. 15|. Так, среди 154 зарегистрированных фенотипически значимых мутаций мтДНК 116 или 73% являются гстероплазмичными. При этом 98 или 61.6% являются абсолютно гетероплазмичными, а у носителей 18 (11.3%) мутаций у одних индивидов присутствует гетеро- у других - гомоплазмия. И лишь для 43 мутаций (27.0%) подтверждена гомоплазмия. Распространенность гетероплазмии среди мутаций мтДНК обусловлена состоянием частичной фиксации, то есть существованием короткоживущего (2-5 поколении) переходного состояния, обычно завершающегося формированием мутантного генa или возвратом к гену «дикого» типа.

Итогом выполненных исследований и современных данных о распространенности гете-роплазмии может стать возврат к неопределенной модели в качестве основной. При этом вероятность доказательности идентификации останков последнего русского Императора может составить менее 70:1, что вряд ли приемлемо для данного случая.

В июле 2003 года исполнилось 85 лет, прошедших с той трагедии. На месте дома Ипатьева построен «Храм на крови», величественность которого отражает ту единственную определенность, имеющуюся пока в этом вопросе.